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電泳遷移實(shí)驗(yàn) EMSA
2015-02-27昀冠科學(xué)商城新聞編輯
1、核蛋白的提取
①用 細(xì) 胞 刮子刮取RAW264.7細(xì)胞與VSMC，移入2.5mlEP 管中。②將細(xì)胞用冰冷PBS洗兩遍，于4℃, 5000g離心3min，沉淀細(xì)胞。③加5倍細(xì)胞體積的冰浴緩沖液A洗細(xì)胞一次，于4℃,5000g離心3 min沉淀細(xì)胞.④加3倍細(xì)胞體積的冰浴緩沖液A懸浮細(xì)胞，冰上放置30 min、劇烈振蕩10次，4℃,5000g離心15min，去上清，沉淀為細(xì)胞核。⑤加與細(xì)胞等體積的冰浴緩沖液B，充分混勻，冰上放置30m in后，于40℃ ,15 000g離心15min,上清為核蛋白。⑥取2ul核蛋白Bradford法測(cè)定核蛋白濃度，分裝后于-70℃保存。
2.探針的標(biāo)記與純化
A、 探 針 的標(biāo)記:將以下試劑加入冰浴中的0.5m l的EP管中，總體積20時(shí)。①未標(biāo)記的探針:2ul (50ng);② 10 x激酶緩沖液:2g1;③ [y-32P]ATP: 4ul (40 uCi);④T4多聚核甘酸激酶:lul (10U);⑤超純水:11ul。
B.混勻后37℃水浴30分鐘;
C、加入5u1 1%SDS/100 mM EDTA短暫渦旋混勻，以終止激酶反應(yīng);
3、探針的純化
①準(zhǔn) 備 MicroSpin' G25分離柱;②輕輕渦旋分離柱以重懸管內(nèi)樹脂;③將蓋子擰松1/4后去掉管底密封;④將分離管放入一只1.5mlEP管中(EP管作支撐用)⑤ 735g離心l分鐘;⑥加入樣品:⑦分離管放入一只新的1.5 mlEP管中，緩慢將樣品加入樹脂床角度平面的中央，735g離心1分鐘;⑧將75ul超純水加入分離柱，735g離心1分鐘;⑨收集支撐管內(nèi)純化好的探針，小心丟棄分離管。
4,測(cè)定探針的放射活性
取1ul純化的探針，用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量其放射活性，放射活性大于1* 10 5cpm/ul示標(biāo)記成功。
5,凝膠遷移阻滯法測(cè)定NF-KB
A、 按下 列 順序分別將各反應(yīng)成分加入第一套做好標(biāo)記的EP管內(nèi):①結(jié)合緩沖液:4ul ②穩(wěn)定液D: 2 ul;③核提取物:lug;④去離子水至:16ul.
B、用移液槍輕輕吸打混勻，4 0C下將核提取物預(yù)孵育20分鐘，
C、在核提取物預(yù)孵育期間，按下列順序依次將各成分加入做好標(biāo)記的第二套EP管內(nèi):①結(jié)合緩沖液:2ul;②穩(wěn)定液D:1ul;③探針:lul;④去離子水:4ul。
D、將探針棍合物加入預(yù)孵育好的核提取物混合物中，用移液器輕輕吸打混勻后，4℃繼續(xù)孵育20分鐘。
E,EMSA測(cè)定:預(yù)先將5%非變性丙烯酞胺膠(38:2 )和電泳緩沖液(1X TGE)預(yù)冷至4℃,然后:①將每反應(yīng)管內(nèi)所有反應(yīng)物加入樣品孔中。同時(shí)在一空白孔中加入含溟酚藍(lán)的上樣緩沖液，以觀測(cè)膠的移動(dòng)情況。當(dāng)溟酚藍(lán)電泳至玻璃板下1/3即可停止電泳(約2小時(shí))。②電泳:12.5V/cm(400px玻璃板為200V)a
F、放射自顯影:電泳完畢后，取出凝膠，用保鮮膜封好;將凝膠與放入有增感屏的曝光盒中，于一70℃ 放射自顯影24小時(shí)。然后將X光片在顯影液中顯影30sec-1min，在定影中定影15-30min，清水沖洗干凈后自然晾干。
G、圖像分析:將各測(cè)量組的電泳照片掃描至計(jì)算機(jī)，然后應(yīng)用Bandscan分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度測(cè)定，并計(jì)算平均光密度值(OD)，以各條帶的OD值表示相應(yīng)核轉(zhuǎn)錄因子的活性
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